18:1 BIOTINYL PE（生物素化的 18 碳單不飽和磷脂酰乙醇胺）是一種生物素修飾的磷脂，其中 “18:1" 指分子中含 18 碳單不飽和脂肪酸鏈（通常為油?；?，即 Δ9 - 十八碳烯?；?，“PE" 代表磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine），“BIOTINYL" 表示乙醇胺的氨基被生物素基團(tuán)修飾。其制備核心是通過化學(xué)方法將生物素基團(tuán)偶聯(lián)到 18:1 PE 的氨基上，常用方法如下：
18:1 PE 的結(jié)構(gòu)中，甘油骨架的 3 位連接磷酸乙醇胺基團(tuán)，其中乙醇胺的末端含游離氨基（-NH?）；生物素分子（biotin）含羧基（-COOH），需先活化羧基使其具備與氨基反應(yīng)的活性，再通過酰胺化反應(yīng)與 18:1 PE 的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵（-CONH-），最終得到生物素化產(chǎn)物。
利用 N - 羥基琥珀酰亞胺（NHS）活化生物素的羧基，生成高活性的 NHS - 生物素酯，再與 18:1 PE 的氨基反應(yīng)。
原料準(zhǔn)備
18:1 PE：通常為1,2 - 二油?；?- sn - 甘油 - 3 - 磷酸乙醇胺（DOPE），因油酰基（18:1 Δ9c）是最常見的 18 碳單不飽和脂肪酸鏈，可通過商業(yè)購(gòu)買或?qū)嶒?yàn)室合成。
生物素活化試劑：NHS - 生物素（N-hydroxysuccinimide biotin，商業(yè)可得，或自制：生物素與 NHS 在碳二亞胺如 DCC 催化下反應(yīng)生成）。
溶劑：選用磷脂和生物素衍生物均溶解的有機(jī)溶劑，如氯仿 / 甲醇混合液（體積比 2:1） 或二氯甲烷。
催化劑：加入有機(jī)堿（如三乙胺）中和反應(yīng)生成的酸，促進(jìn)酰胺化反應(yīng)。
反應(yīng)過程
將 DOPE（1 eq）溶于上述溶劑，加入過量的 NHS - 生物素（1.2-1.5 eq，過量提高反應(yīng)率），再滴加少量三乙胺（1-2 eq）。
室溫下攪拌反應(yīng) 4-12 小時(shí)（可通過 TLC 監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)度，展開劑用氯仿 / 甲醇 / 水 = 65:25:4）。
反應(yīng)原理：NHS - 生物素的酯基與 DOPE 的氨基反應(yīng)，釋放 NHS，形成生物素 - PE 酰胺鍵。
產(chǎn)物純化
反應(yīng)結(jié)束后，旋蒸除去溶劑，殘留固體用少量氯仿溶解。
通過硅膠柱層析純化：以氯仿 / 甲醇混合液（初始比例 9:1，逐步提高甲醇比例至 7:3）為洗脫劑，收集含目標(biāo)產(chǎn)物的流分（TLC 檢測(cè)，Rf 值低于原料 DOPE，因生物素增加極性）。
合并純流分，旋蒸干燥，得到白色或類白色固體產(chǎn)物 18:1 BIOTINYL PE。
若直接使用生物素（而非 NHS - 生物素），可通過 1 - 乙基 - 3-（3 - 二甲基氨基丙基）碳二亞胺（EDC）活化羧基，同時(shí)加入 NHS 穩(wěn)定活化中間體，提高反應(yīng)效率。
溶劑選用DMF（二甲基甲酰胺）或氯仿 / 甲醇混合液，避免水過多（EDC 在水中易水解）。
依次加入 DOPE（1 eq）、生物素（1.2 eq）、EDC（1.5 eq）、NHS（1.5 eq），室溫?cái)嚢?8-16 小時(shí)。
純化步驟同方法 1（硅膠柱層析）。
利用脂肪酶或酰胺合成酶催化生物素與 18:1 PE 的偶聯(lián)，適用于對(duì)化學(xué)試劑敏感的場(chǎng)景，但效率較低，較少用于大規(guī)模制備。
溶劑選擇：需兼顧磷脂（疏水性）和生物素衍生物（中等極性）的溶解性，避免使用強(qiáng)極性溶劑（如純水）導(dǎo)致磷脂析出。
反應(yīng)條件：控制溫度（室溫為宜，高溫可能導(dǎo)致磷脂氧化或生物素分解）和 pH（弱堿性環(huán)境利于氨基親核攻擊）。
純化驗(yàn)證：通過核磁共振（1H NMR，檢測(cè)生物素特征峰 δ 4.3-4.5）、質(zhì)譜（ESI-MS，目標(biāo)分子量約 1000-1100 Da）確認(rèn)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)。
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2025-08-08
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